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通过荧光成像和血液检测实现对肝脏谷胱甘肽消耗的无创监测
大家好，今天给大家推荐的文章是2月发表在ScienceAdvances上的论文，通讯作者是德克萨斯大学达拉斯分校郑杰教授。
肝谷胱甘肽(GSH)是肝脏中主要的抗氧化剂，是维持肝脏氧化还原环境的关键。从肝细胞中不断流向血液的谷胱甘肽能够精确调节整个身体的氧化还原电势。目前已发现肝脏谷胱甘肽的消耗程度与许多药物引起的肝损伤、酒精/非酒精性脂肪肝病、肝病、肝纤维化和肝硬化相关。但是，与传统的肝脏血清标记物,如丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)相比，很难无创监测肝脏中的谷胱甘肽(~7mM)，特别是进入血液循环血浆后谷胱甘肽被稀释两个数量级以上(~30μM)。然而，在临床前和临床研究中，手术或肝活检通常需要测定体外肝脏谷胱甘肽的浓度。在最近的研究中，13C-GSH核磁共振被用来监控注入[2-13C]甘氨酸后肝脏中谷胱甘肽的合成。这种技术拥有先进的无损检测技术，但医院在有限的资源情况下，无法使用这种高端仪器设备开展监测，临床患者谷胱甘肽消耗的监测仍然非常困难。如果能够对谷胱甘肽进行特定和准确的标记，荧光成像和血液检测被认为是一种低成本且适用于用于临床前研究的方法。
基于此，德克萨斯大学达拉斯分校郑杰教授课题组在肝窦中利用GSH-介导的金纳米粒子的生物转化，使用GSH激活的和自身可清除的纳米探针用于监测肝窦中谷胱甘肽的消耗，并实现了对体内荧光成像或血液测试(图1)。这个纳米探针是由Au25纳米簇保护的吲哚菁绿(ICG)-GSH(ICG4-GS-Au25)组成，其中ICG可被释放，GSH可重新激活ICG的近红外荧光发射。通过小鼠静脉注射后，首次发现ICG荧光激活动力学在肝脏谷胱甘肽水平控制的小鼠中与肝脏谷胱甘肽浓度线性相关。此外，这种肝脏中GSH依赖的纳米探针的线性激活可以成功地用于监测醋氨酚(APAP)诱导的肝损伤后小鼠肝脏中GSH的消耗，这是药物性肝损伤最常见的原因。因为ICG在肝窦中特异性的释放，而不是在外围血液循环，ICG4-GS-Au25与肝脏谷胱甘肽水平具有很好的相关性。作者进一步通过一个简单的血液测试，精度高的连续监测小鼠肝脏损伤和恢复过程中肝脏谷胱甘肽的消耗情况。因为肝脏谷胱甘肽耗竭通常发生在肝细胞的死亡，所以可以作为肝功能的生物标志物，通过简单的临床前成像工具和血液测试早期检测和无损监测肝脏谷胱甘肽的消耗，将极大推进对肝脏氧化应激相关疾病的理解。
图1通过体内荧光成像和血液测试，ICG4-GS-Au25能够无创地监测肝GSH消耗的示意图。静脉内给药后，ICG4-GS-Au25纳米探针与血清蛋白结合并有效的转运至肝脏，在肝脏中其表面化学物质通过肝窦于外排在细胞外的GSH发生生物转化，从Au25的表面置换出ICG-GS部分并激活ICG的NIR荧光，因此可以通过体内荧光成像监测肝脏GSH。经过生物转化并激活的ICG荧光相当稳定，并将携带有肝GSH的信息带回血液循环，因此在从Au25中分离出剩余的ICG-GS后，可以从外周血中检测出肝GSH的水平。
如图2所示，ICG偶联到GS-Au25上后，导致ICG吸收峰从nm蓝移到nm，这是由于多个ICG分子在同一Au25表面上的H偶联效应造成的(图2A)。由于Au25与共轭ICG的距离很近，ICG的近红外荧光有效的光诱导电子转移过程几乎完全猝灭(99.2%)。而当游离GSH将ICG-GS从Au25表面置换后，ICG的近红外荧光瞬间恢复，近红外荧光发射增强了倍以上。在含有0.2~1mMGSH的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中孵育ICG4-GS-Au25，发现ICG荧光激活随孵育时间的变化在孵育的前s内呈准线性关系(图2B)。此外，荧光激活动力学与GSH浓度均呈线性相关(图2C)，表明GSH介导的ICG荧光激活动力学在体外水平上为二级反应。这些结果表明，ICG4-GS-Au25的荧光激活动力学可以用来测定GSH浓度。
由于ICG与血清蛋白的高亲和力，ICG4-GS-Au25也与血清蛋白有很强的结合，一旦血清蛋白进入血液，ICG4-GS-Au25就会被快速转运到肝脏。为了检测ICG4-GSAu25在肝脏中的荧光激活动力学是否也与体内肝脏GSH水平线性相关，作者用不同剂量的马来酸二乙酯(一种谷胱甘肽选择性消耗剂)，可以暂时消耗肝脏谷胱甘肽并控制肝脏谷胱甘肽水平。在DEM处理30min后，将ICG4-GS-Au25静脉注射到小鼠体内，s内对肝脏进行无创动态体内荧光成像，然后立即采集肝脏组织样本，直接在体外测量提取的肝脏GSH水平。如图2(D,E)所示，在没有DEM处理的小鼠，静脉注射ICG4-GS-Au25导致立即激活肝脏中ICG荧光，因为肝窦细胞生成的谷胱甘肽局部浓度较高，GSH-介导的还原谷胱甘肽和半胱氨酸的等离子胱氨酸一起从GS-Au25释放，激活ICG在体内的荧光发射。在经DEM处理的小鼠中，随着DEM剂量的增加，肝脏ICG荧光激活动力学相应降低，并表现出准线性特征(图2D,E)。通过直接测量提取肝脏体外的谷胱甘肽水平，作者进一步证实，DEM治疗导致肝脏谷胱甘肽水平明显降低~6.6μmol/g。通过绘制肝脏谷胱甘肽水平与肝脏荧光激活ICG4-GS-Au25动力学，发现相应的激活肝脏组织动力学荧光从71s?1降低至33和12s?1,与肝脏谷胱甘肽水平降低表现出很强的线性相关，且与体外水平观察一致(图2F)。
图2体外和体内ICG4-GS-Au25的荧光激活动力学与GSH水平的线性关系。(A)ICG4-GS-Au25、游离ICG和GS-Au25纳米团簇的吸收光谱，插图是ICG4-GS-Au25结构示意图。(B)ICG4-GS-Au25在含不同GSH浓度的PBS中培养时的ICG荧光强度随时间变化。(C)GSH浓度与ICG4-GS-Au25ICG荧光恢复动力学的相关性。(D)使用不同剂量的马来酸二乙酯(DEM)预处理30分钟后，小鼠静脉注射相同剂量的ICG4-GS-Au25，体内活性ICG的荧光图像(箭头指向)。(E)注射同剂量ICG4-GS-Au25后，小鼠肝脏ICG荧光强度随时间变化曲线。(F)单个小鼠肝脏GSH水平与肝脏ICG荧光动力学的相关性。
先前的体外研究表明，剂量依赖的毒素如APAP，会在过量后导致肝脏谷胱甘肽耗竭。然而，肝脏谷胱甘肽耗竭从未被用于活体荧光成像技术无创检测。基于此，作者通过腹腔注射过量的APAP(mg/kg体重)、正常剂量的APAP(60mg/kg体重)和生理盐水作为对照，建立了APAP诱导的肝损伤小鼠模型。给药30min后，静脉注射等量ICG4-GS-Au25(~3nmol)，对小鼠进行体内荧光成像。如图3(A,B)所示，APAP过量小鼠肝脏ICG荧光激活明显慢于对照组和正常剂量小鼠。定量分析显示，过剂量小鼠的肝脏荧光激活动力学为20±1.6s?1，约为对照组(41.6±7.9s?1)和正常剂量小鼠(40.4±7.1s?1)的50%(图3C)。另一方面，在ICG4-GS-Au25注射5min后，APAP过量小鼠肝脏中Au的积累[7.5±0.59%注射剂量(ID)/g]甚至略高于对照小鼠(6.1±0.16%ID/g)。因此，肝荧光激活动力学的显著降低不是由于纳米探针在肝脏中的积累减少的造成的。为了进一步确定激活动力学降低的原因，在体内荧光成像后立即对对照组小鼠和正常剂量APAP和过量APA小鼠提取的肝脏的谷胱甘肽水平进行了体外定量。如图3D所示，过量给药小鼠肝脏GSH水平为2.1±1.2μmol/g，仅为对照组(6.0±0.1μmol/g)和正常给药小鼠(6.6±0.8μmol/g)的32~35%。综合这些结果清楚地表明，肝荧光激活动力学的显著降低是由于肝GSH不足的APAP过量小鼠。在APAP注射前4小时(正常状态)和APAP注射后0.5、4、8和18h重复给同一只小鼠使用纳米探针，并监测它们的肝脏ICG荧光激活动力学，发现它们之间与各时间点肝脏谷胱甘肽水平的变化有很好的相关性(图3E,F)。肝GSH水平从注射过量APAP后的6.74±0.32μmol/g(正常状态)迅速下降到注射后4小时后的2.88±0.34μmol/g组织，随后逐渐恢复到6.40±0.78μmol/g，这与文献报道一致。
图3ICG4-GS-Au25荧光成像监测药物诱导的肝脏谷胱甘肽消耗。(A)APAP诱导的肝损伤小鼠模型中，静脉注射相同剂量的ICG4-GS-Au25后，小鼠体内无创荧光图像显示肝脏内ICG荧光激活(箭头指向)。在ICG4-GS-Au25注射前30min，小鼠腹腔注射过量APAP(mg/kg)、正常剂量APAP(60mg/kg)或生理盐水(0mg/kg)作为对照。(B)注射相同ICG4-GS-Au25后，APAP处理小鼠肝脏后ICG荧光曲线随时间变化。(C)不同剂量APAP处理小鼠肝脏ICG荧光动力学的比较。(D)体内荧光成像后立即在体外测量肝脏谷胱甘肽水平。(E)通过反复给药ICG4-GS-Au25连续监测同组APAP过量小鼠肝脏GSH水平。小鼠0小时腹腔注射APAP(mg/kg体重)，注射APAP前4h(正常状态)及注射后0.5、4、8、18h进行肝脏荧光成像。N=3只小鼠连续肝荧光成像。取5组小鼠(每组3只)，用肝组织体外直接测定APAP注射前后不同时间点肝脏GSH水平。
本文作者：DSX
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