文章来源
中华肝脏病杂志，,28（11）:-
作者：郑秀袁春旺崔雄伟吕福东赵大伟刘红刚冯骥良
DOI:10./cma.j.cn--
摘要
目的
观察细胞角蛋白19/磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（CK19/GPC3）的表达模式与肝细胞癌患者介入治疗术后复发的相关性。
方法
医院年11月至年5月接受介入治疗的符合条件的例肝细胞癌患者的临床及病理资料，并对可能影响其预后的相关风险因素进行了单因素和多因素COX回归分析。Kaplan-Meier生存分析法绘制患者生存曲线，Log-rank检验比较各组间生存率的差异。
结果
Kplan-Meier单因素分析显示组织学分级、CK19/GPC3表达模式、甲胎蛋白水平及HepPar1与肿瘤复发密切相关，多因素COX回归分析显示CK19/GPC3表达模式（HR=1.，95%CI为1.～2.，P=0.）、组织学分级(HR=1.,95%CI为1.～2.，P=0.)、甲胎蛋白水平（HR=1.，95%CI为1.～1.，P=0.)、HepPar1(HR=0.，95%CI为0.～0.，P=0.)4个因素为介入治疗后复发的独立预测因子。
结论
符合米兰标准的具有CK19?/GPC3?与CK19?/GPC3?表型的肝细胞癌患者介入治疗后较CK19?/GPC3?的患者具有更高的复发风险。
正文
肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）为全球第六大常见癌症，且是癌症相关死亡的第四大原因。HCC侵袭性强、恶性度高、治疗效果差，导致5年生存率非常低[1-2]。在大多数情况下，HCC是在慢性肝病的既定背景下发生的（占所有患者的70%～90%）[3-5]。肝硬化是手术后总体生存率和无复发生存率的重要危险因素[6]，因此，肝癌的治疗通常与肝硬化有关，既需要肿瘤根治，又需要某种程度上的保守，以维持肝功能的稳定。Sasaki等[7]通过比较肝癌的复发模式及年复发率，发现肝硬化组患者较非肝硬化组患者预后较差可能与肝硬化背景具有更高的肝癌复发潜能相关。
年欧洲肝脏研究学会（EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver，EASL）会议指出，对于米兰标准内的大部分患者，经肝动脉化疗栓塞（transcatheterarterialchemoembolization，TACE）及消融治疗的预期效果与手术相当，并且表现出更大的成本效益[8-9]。近些年，医学的快速发展使肝癌的短期生存率得到了改善，但其高复发性仍是当前面临的巨大挑战。大多数研究从肝癌肿瘤大小、数量及临床血清学标志物等方面来评估预后，而肿瘤组织学分子标志物领域仍少见报道。Feng等[10]基于细胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）在HCC起源于肝脏祖细胞（hepaticprogenitorcells，HPC）、未成熟的肝细胞和终末分化的肝细胞中的不同表达，进行了CK19?/GPC3?、CK19?/GPC3?和CK19?/GPC3?表达模式的亚型分型，这些患者的肝内播散、脉管内瘤栓、局部淋巴结受累和远处转移的发生随上述分型逐次降低。这一研究结果表明，HCC的细胞学起源与肿瘤细胞的侵袭性生物学行为密切相关。基于这一分子分型系统，他们对经肝移植和外科根治性切除治疗的HCC患者的早期复发进行了研究，发现整合了CK19/GPC3分型系统的预测模型可以对上述患者预后进行很好的分层[11-13]。本研究旨在以HCCCK19/GPC3分型系统为基础，对经介入治疗后HCC患者的早期复发进行预后风险评估。
资料与方法
1.材料收集：
回顾性收集年11月至年5医院接受介入治疗的例肝癌患者的临床病理资料，包括：年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、免疫组织化学分子标志物CK19、GPC3、HepPar-1和有无脉管内瘤栓、淋巴结转移、远处转移、有无肝硬化病变背景、甲胎蛋白、介入治疗具体方式、Child-Pugh分级、病原学检查、有无复发、无复发生存时间等，并对所有患者进行术后随访。所有病例均有病理检查结果证实为原发性HCC。所有患者严格按照米兰标准分期。米兰标准定义为单个肿瘤≤5cm，或者肿瘤个数≤3且肿瘤最大直径≤3cm。复发定义为单个结节的介入治疗疗程结束或者多个结节的多次治疗总疗程结束后，患者再次出现具有HCC特征的肝脏局灶性病变、肝门淋巴结肿大或疑似肝外病变，必要时经影像学检查及病理证实。
2.患者入组条件：
（1）符合米兰标准患者；（2）患者有肝硬化背景；（3）肝功能Child-Pugh评分为A或B级；（4）患者在这之前未接受过手术、移植、放疗、化疗等相关抗肿瘤治疗；（5）患者临床上无其他并发肿瘤及相关严重并发症等疾病。根据选择标准，排除87例患者，剩余例患者入组本研究的队列。
3.免疫组织化学染色：
采用免疫组织化学EnVision法染色，所有切片均由初级病理医师进行预诊断，再由两名副主任及以上病理医师复诊。CK19和GPC3主要在细胞质和细胞膜上表达（鼠抗人CK19单克隆抗体：CloneBA17，稀释度，1∶；鼠抗人GPC3单克隆抗体：Clone1G12，稀释度，1∶；均购自美国Zeta公司）。所有切片以超过10%的肿瘤细胞表达判读为阳性，不着色及表达部位不符合判读标准的为阴性。CK19以周围正常胆管上皮细胞胞质着色作为阳性对照，GPC3以卵黄囊肿瘤细胞胞质及胞膜的着色作为阳性对照；用原始抗体替代品作为阴性对照。
4.统计学方法：
数据分析采用SPSS23.0统计软件。分类变量和连续变量的分布用χ2检验，单因素分析检验无复发生存期（recurrencefreesurvival，RFS）与其可能的预后相关因素，包括性别、年龄、CK19/GPC3表达模式、HepPar1、组织学分级、Child-Pugh分级、脉管内瘤栓、肿瘤个数、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移及介入治疗具体方式。Kaplan-Meier生存分析法绘制患者生存曲线，Log-rank检验比较各组间生存差异。对与RFS相关的数据进行多重共线性诊断，方差膨胀因子(varianceinflationfactor，VIF)＞10提示各参数间有多重共线性。COX风险回归模型评估各因素对预后的影响。以P0.05为差异有统计学意义。
结果
1.研究队列的基线特征：
本研究共有例米兰标准内伴有肝硬化背景的患者接受了介入治疗。患者的基线特征见表1。患者无复发生存时间从1个月～81个月；其中有例（76.5%）患者复发，59例（23.5%）未复发。表中可以看出HCC好发于50岁以上男性，以单个结节为主。就治疗方式而言，患者分为TACE组、TACE+射频消融（radiofrequencyablation，RFA）组、TACE+微波消融（microwaveablation，MWA）组和TACE+冷冻消融（cryoablation）组，但各组生存曲线之间的差异无统计学意义（图1）。
2.甲胎蛋白(AFP)水平与肿瘤直径：
患者血清AFP水平0.61～ng/ml。根据约登指数确定受试者操作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲线上最大化的截断值是35.02ng/ml[AUC=0.，95%CI为0.～0.，P=0.；灵敏度为54.3%，特异度为71.7%]（图2A）。同理，肿瘤直径约0.5～6.9cm，ROC曲线上最大化的截断值是3.5cm[AUC=0.，95%CI为0.～0.，P=0.；灵敏度为43.5%，特异度为75.0%]（图2B）。
3.CK19/GPC3分型系统与其他因素之间的关系：
将CK19/GPC3分型与其他因素进行χ2相关性检验（图3）。CK19/GPC3表达模式与组织学分级呈中度相关（R=0.，P0.05），CK19?/GPC3?组、CK19?/GPC3?组人群集中在中、低分化（%、88.4%），CK19?/GPC3?组几乎没有高分化，而CK19?/GPC3?组大多数为高分化（65.9%）。尽管在结节个数、脉管内瘤栓、淋巴结转移及远处转移方面，差异无统计学意义（P0.05），仍可以看出CK19?/GPC3?组和CK19?/GPC3?组发生多个结节比例明显高于CK19?/GPC3?组（16.7%、17.4%与9.8%），而CK19?/GPC3?组大多数为单个结节。CK19?/GPC3?组发生脉管内瘤栓比例明显高于CK19?/GPC3?组、CK19?/GPC3?组（13.3%与6.4%、4.9%），而CK19?/GPC3-组很少出现脉管内瘤栓。CK19?/GPC3?组、CK19?/GPC3?组发生远处转移的比例明显高于CK19?/GPC3?组（10.0%、8.7%与2.4%），而CK19?/GPC3?组患者很少出现远处转移。
4.单因素分析肿瘤早期复发相关因素：
Kaplan-Meier法估计生存率,绘制生存曲线（图4）。结果表明，组织学分级（2级P0.05；3级P0.05）、CK19/GPC3免疫表型(2层分型P0.05；3层分型P0.05)、HepPar1（P0.05）及血清AFP水平是影响该队列介入治疗后早期复发的相关因素。鉴于组织学分级组内差异明显（高分化与中分化，P=0.；高分化与低分化，P=0.；中分化与低分化，P=0.），我们将高分化和中分化并入同一组。CK19/GPC3表达模式组内差异明显（CK19?/GPC3?与CK19?/GPC3?，P=0.；CK19?/GPC3?与CK19?/GPC3?，P=0.；CK19?/GPC3?与CK19?/GPC3?，P=0.），我们将CK19?/GPC3?和CK19?/GPC3?并入同一组。其中组织学分级、CK19/GPC3表达模式、HepPar-1是影响RFS的独立预测因子。
5.多重共线性分析：
由于影响因素之间的共线性可能会影响回归系数，我们以容忍度和方差膨胀因子作为共线性分析的验证结果。本研究中单因素分析有统计学意义的参数在共线性分析中，所有参数VIF值均10（最大值VIF=1.），提示各变量之间不存在共线性。
6.多因素COX回归分析影响HCC复发的预后因素：
我们将在单因素分析及ROC曲线中影响复发率的4个参数（组织学分级、CK19/GPC3表达模式、HepPar1、AFP水平）代入多因素COX回归分析。结果表明，CK19/GPC3表达模式[危险比（HR）=1.,95%可信区间（CI）为1.～2.，P=0.]、组织学分级（HR=1.,95%CI为1.～2.，P=0.）、AFP水平(HR=1.,95%CI为1.～1.，P=0.)、HepPar1(HR=0.，95%CI为0.～0.，P=0.)，4个因素为介入微创术后早期复发的独立预测因子。CK19?/GPC3?和CK19?/GPC3?组、CK19?/GPC3?组复发的中位时间分别为17个月和36个月。CK19?/GPC3?和CK19?/GPC3?组患者在介入微创术后复发的风险较CK19-/GPC3-组高。见表2。
讨论
本研究发现在HCC患者介入治疗的队列中，CK19?/GPC3?和CK19?/GPC3?组较CK19?/GPC3?组术后复发风险更高。多变量分析显示CK19/GPC3分子分型、组织学分级、血清AFP水平和HepPar-1的表达是HCC患者RFS的独立预测因子。整合4个变量可能对符合米兰标准的HCC介入之后的早期复发进行预测。
现今针对早期肝癌的治疗方式主要是肝切除和介入微创治疗。EASL会议指出：热消融治疗是对于3cm结节的广泛使用的治疗方法，并且其效果与手术切除效果相当；对于较大的单个结节（3～5cm），手术切除预期效果及成本投入相对于消融更好；对于2～3个结节（3cm），消融与手术治疗的预期效果相当[9]，并且消融表现出的成本效益更大。HCC是一个具有很高异质性的疾病。以往对其治疗方法的选择基本依赖于肿瘤直径和结节个数。肿瘤的细胞生物学行为是决定治疗效果最重要的决定因素之一。一些具有高侵袭性的肿瘤可能在影像学检测发现的“早期阶段”已经发生了肝内或肝外播散。本研究整合了CK19/GPC3分型、血清AFP水平和HepPar-1表达3个分子标志物，相对于依赖肿瘤直径和结节个数的方法具有更精准的复发预测性能。
多学科联合对HCC患者的治疗策略的制定和治疗后疗效的评估至关重要。尤其是患者首诊的治疗策略对患者的总生存期、花费、不良反应及可能的生存获益具有重要影响。我们以往用CK19/GPC3分型系统结合其他指标，分别对HCC肝移植、根治性手术切除后的早期复发建立了预测模型[10-13]。结合本研究，基本形成了一套基于肝穿刺活组织检查HCC的预后评估体系。尽管一些指标，如AFP、肿瘤直径等的切割值还需要在更大样本的队列中进行验证，随着我们多中心联盟单位数据的共享和随访体系的整合，更加精确的评估体系会进一步提升和完善。
本研究尚有诸多不足之处，如非手术治疗的病理诊断主要依赖于肝穿刺活组织检查，由于穿刺组织较少，在对肿瘤的CK19/GPC3分型、HepPar-1染色、组织学分级、脉管内瘤栓等评估方面具有一定的局限性。并且，对于微小肿瘤，活组织检查本身就具有挑战性。最后，本研究最重要的限制是其回顾性设计。有限的样本量可能降低了比较分析的潜能，尤其CK19?/GPC3?患者较少，导致CK19?/GPC3?组和CK19?/GPC3?组患者的累积RFS差异不明显。未来将收集更多的病例，做出更精确的风险分层，推广应用至临床。
参考文献
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